***
Из неопубликованных воспоминаний Елены Александровны Салменковой о популяционно-генетических исследованиях нерки оз. Азабачьего:
«История популяционно-генетических исследований на биостанции «Радуга» на оз. Азабачьем началась в 1971 г. благодаря тому, что научные интересы двух молодых ученых нового Института биологии моря ДВНЦ РАН кандидатов наук – Станислава Максимовича Коновалова (заведующего лабораторией популяционной биологии) и Юрия Петровича Алтухова (заведующего лабораторией генетики) оказались очень близкими.
В итоге совместных обсуждений проблем популяционной биологии, которая в то время стала бурно развиваться, возник план совместной работы. Согласно ему, экспедиционные исследования популяционной биологии нерки, уже начатые годом раньше на оз. Азабачьем, теперь должны были включить и генетический раздел.
Станислав Максимович был увлечен общей теорией систем и ее приложением к популяционной биологии, а Юрий Петрович, совместно с Ю. Г. Рычковым, недавно опубликовали статью с обоснованием системного принципа организации популяций (Алтухов, Рычков, 1970). В азабачинском изоляте (популяции, локальном стаде – курсив В. Ф. Бугаева) нерки они видели яркий пример популяционной системы, поскольку, по мнению Коновалова (Коновалов, 1981), среди камчатских популяций изолят нерки оз. Азабачьего имеет наиболее сложную структуру, включающую весеннюю и летнюю расы, большое число экологически различных нерестилищ, приуроченных к чашам, ручьям (рекам) и к прибрежной зоне внутри озера.
Из работ Хартмана и Рэли (Hartman, Raleigh, 1964), проведенных с помощью мечения на нерке двух канадских озер, уже было известно о высокой степени изоляции половозрелой нерки отдельных нерестилищ (превышающей 90 %) в пределах одного озера. Фактически изолят являл собой целый «микромир», а значит, был интересным и перспективным объектом для всесторонних популяционных исследований.
Как раз в эти годы стали активно разрабатываться электрофоретические методы разделения наследственных вариантов белков, в основном ферментной природы, позволявшие изучать изменчивость (полиморфизм) кодирующих их генов. Это означало, что появилась возможность генетически характеризовать популяцию и ее структурные компоненты, определяя в выборках из них генотипический состав, частоты аллелей полиморфных генов и выявляя генетическую дифференциацию между компонентами популяционной структуры. Мы воспользовались этими методами для изучения популяционно-генетической структуры изолята нерки оз. Азабачьего.
Итак, в соответствии с разработанным руководством планом, было начато параллельное исследование основных биологических и популяционно-генетических характеристик нерки, размножающейся на многочисленных нерестилищах озера, названных субизолятами или субпопуляциями. В собранных на нерестилищах выборках нерки проводили измерения длины и массы тела, определение возраста по чешуе и ряда других параметров, для генетического анализа от каждой рыбы брали образцы крови и скелетных мышц.
На самих нерестилищах подсчитывали количество производителей и соотношение полов и на этом основании определяли эффективную численность субпопуляций. Именно от эффективной численности зависит динамика генетических процессов в популяциях, и оценка эффективной численности.
Это тот параметр, который необходим для анализа получаемых генетических данных и выяснения механизмов, поддерживающих генетическую структуру изолята. В образцах крови и мышц с помощью электрофоретического анализа определяли генотипы каждой рыбы по полиморфным (содержавшим каждый по два аллеля) генетическим локусам, кодируюшим ферменты лактатдегидрогеназу и фосфоглюкомутазу.
Оба фермента занимают ключевые позиции в процессах метаболизма (в гликолизе), поэтому можно было ожидать, что полиморфизм в этих локусах окажется адаптивно значимым. Таким образом, в выборках нерки с каждого субизолята были определены частоты аллелей названных выше двух локусов, обозначенных, согласно правилам номенклатуры для рыб (Shaklee et al., 1990), как LDH-B2* и PGM-2*.
Как уже говорилось, для нерки оз. Азабачьего характерно наличие ранней (весенней) и поздней (летней) рас; ранняя нерка размножается в впадающих в озеро ручьях или речках и в образуемых выходами грунтовых вод чашах, а поздняя нерка – на участках литорали самого озера. В озере насчитывается примерно 30 таких нерестилищ.
За ряд полевых сезонов в период 1971-1984 гг. были собраны биологические и генетические характеристики более 10000 рыб почти из всех субпопуляций, разделенных пространством и временем. Прежде всего выяснилось, что несмотря на ярко выраженные различия частот генов между субпопуляциями, для стада в целом на протяжении практически всех сезонов наблюдается устойчивость средних значений частот аллелей и их дисперсий по локусам LDH-B2* и PGM-2*, то-есть генетическая структура стада остается стабильной в поколениях (Алтухов, 1989).
В то же время повторяющиеся из года в год различия между локусами в дисперсиях аллельных частот указывали на различия в механизмах поддержания изменчивости этих локусов у нерки. Для анализа вклада таких микроэволюционных факторов как дрейф генов, миграция и отбор мы использовали метод сопоставления наблюдаемых по субпопуляциям распределений аллельных частот с теоретическими распределениями, описываемыми стационарными функциями С. Райта (подробное обоснование этого подхода дано в книгах Ю. П. Алтухова (1974, 1989).
Для такого анализа была использована полученная для азабачинских субпопуляций оценка эффективной репродуктивной величины, равная 200 особям, а необходимая в этом анализе величина межсубпопуляционной миграции оценивалась в 2-3 % на основе данных Хартмана и Рэли (1964).
Выполненные нами расчеты показали, что полиморфизм в локусе LDH-B2* поддерживается в стаде нерки с помощью дрейфа и миграции генов, тогда как полиморфизм в локусе PGM-2* поддерживается не только этими факторами, но и отбором в пользу гетерозигот (Алтухов и др., 1975а,b). Было также найдено, что высокая дисперсия аллельных частот локуса LDH-B2* связана с существенными различиями между расами. По локусу PGM-2*, где дисперсия аллельных частот намного ниже, различий между сезонными расами не наблюдается.
Анализ аллельных частот и их дисперсий отдельно в субизолятах чаш, ручьев и литорали озера показал, что на чашах и ручьях отбор по локусу PGM-2* выражен сильнее, чем на озерных нерестилищах, причем на чашах наблюдается проявление отбора и по локусу LDH-B2* (Рябова и др., 1978; Алтухов, 1989). Какие же характеристики среды могут быть факторами такого отбора? Специальное исследование связи частот аллелей с такими параметрами, как содержание кислорода, рН и температура среды в нерестовых гнездах нерки на различных нерестилищах выявило корреляции только с температурой (Новосельская и др., 1982; Алтухов и др., 1983), которая, очевидно, играет определенную селективную роль.
Дальнейшее исследование было направлено на выяснение связей полиморфизма рассматриваемых локусов LDH-B2* и PGM-2* с размерно-половой структурой. У нерки, как правило, наблюдается половой диморфизм по длине тела: для самок обычно характерна унимодальность, а для самцов – бимодальность, т. е. имеется группа мелких быстрорастущих и раносозревающих самцов и группа крупных созревающих в более старшем возрасте самцов. Было проведено сравнение уровней гетерозиготности, или генного разнообразия по указанным локусам в группах самок, мелких и крупных самцов. Работа проводилась на нерке не только Азабачьего, но и Начикинского, Ближнего и Дальнего озер.
Выяснилось, что группы самок, мелких и крупных самцов различаются по уровню гетерозиготности: у мелких самцов гетерозиготность максимальна, у крупных самцов – минимальна, а самкам свойствен средний уровень гетерозиготности (Алтухов, 1989; Алтухов, Варнавская, 1983). Авторы заключили, что самцы и самки представляют собой две адаптивные системы с максимальной дисперсией приспособленности у самцов.
Особенно интересным оказался тот факт, что высокая гетерозиготность мелких самцов сопряжена со свойственным им ускоренным темпом роста в первые годы жизни и ранним половым созреванием (эти присущие мелким самцам свойства были описаны Ф. В. Крогиус (1960, 1975).
Иными словами, была выявлена ясная связь между повышенным уровнем гетерозиготности рыб по двум ферментным локусам и морфофункциональными признаками, отражающими гетерозис по скорости роста и полового созревания. Особенно высока гетерозиготность у раносозревающих карликов – мелких самцов нерки, не мигрирующих в море (Кирпичников, 1979; Кирпичников, Муске, 1981).
Таким образом, детальное изучение генетической структуры всего лишь по двум ферментным генам (надо сказать, что для нерки вообще характерно малое число полиморфных ферментных генов) показало, что генетический полиморфизм может быть непосредственно связан с биологической структурой изолята.
Разная степень полиморфизма, т. е. различные величины аллельных частот и гетерозиготности характеризуют 1) раннюю и позднюю расы, 2) субизоляты в пределах рас, приуроченные к разным типам нерестилищ (чашам, ручьям и литорали озера), 3) основные группы размерно-половой структуры (самки, мелкие и крупные самцы).
Связь генетической изменчивости с биологической структурой изолята нерки оз. Азабачьего определяется не только случайными процессами дрейфа и миграции генов, но и отбором, особенно заметно проявляющимся на чашах, т. е. полиморфизм этих генов имеет адаптивное значение.
Можно предполагать, что эти гены маркируют адаптивную генетическую систему нерки и ее связь с внутрипопуляционной дифференциацией по таким важным полигенным признакам, как пол, возраст, скорость созревания и роста (Алтухов, 1989). Более того, селективный промысел, направленный на вылов крупных рыб, главным образом самцов, изменяет таким путем биологическую структуру стада и через нее воздействует и на его генетическую структуру.
Происходящие при этом изменения в генетической структуре, такие, как увеличение общего уровня гетерозиготности за счет увеличения среди оставшихся рыб доли мелких самцов, до определенного уровня являются обратимыми именно благодаря повышенному генетическому разнообразию (Алтухов, 1989, 2003).
Материалы этих и сопутствующих исследований вошли в несколько докторских (в частности, диссертации С. М. Коновалова и Ю. П.Алтухова и кандидатских диссертаций В. Т. Омельченко, В. П. Бушуева, А. Ю. Новосельской, Л. И. Ильиной и др.)
Из сопутствующих основной работе исследований стоит упомянуть исследования по гольцам – белому гольцу Salvelinus albus и мальме S. malma. Белый голец был описан из нижнего течения реки Камчатки (из Азабачинской протоки) и позднее из бассейна Кроноцкого озера (Глубоковский, 1977, 1995). Нами и нашими коллегами для доказательства валидности «новичка» использован целый арсенал независимых методов. В частности, анализ полиморфизма аллозимных локусов, изменчивость митохондриального генома и микросателлитных локусов ДНК, был проведен также кариологический анализ (Ефремов, 1991; Олейник, Полякова, 1992, 1994; Osinov, 1999; Salmenkova et al., 2000; Фролов, 2000; Черешнев и др., 2002). Ни в одном случае не получено подтверждения видовой самостоятельности белого гольца по отношению к симпатрично сосуществующей с ним мальме.
Что вспоминается о нашей жизни на Азабачьем озере в те годы? В первом полевом сезоне особые волнения и трения возникали из-за отсутствия постоянного электро-снабжения. Если у наших коллег-ихтиологов отсутствие света не влияло на рабочий процесс (померить и подсчитать необходимые параметры рыб при затянувшемся анализе можно было и при свечах), то без электричества об электрофорезе белков или о постоянной работе холодильников говорить не приходится.
Один из наших коллег вспоминает: «Наша первая электростанция – это совершенно особая история – знаменитый десятикиловаттный дизель-генератор с тлеющими запальными фитилями и с разработанной нами системой охлаждения, которая состояла из доброго десятка соединенных между собой бочек. После такой модернизации этот энергогенерирующий мастодонт вполне был достоин Книги Рекордов Гиннеса».
Однако несмотря на организационные сложности, связанные с завозом строительных материалов, постоянными поломками электростанции, мы успели создать к началу нереста нерки относительно комфортные условия для популяционно-генетических работ.
«Комфортные условия» были действительно очень относительными – наша первая лаборатория располагалась в старом деревянном доме. Рассохшиеся бревенчатые стены позволяли без особого напряжения общаться с находившимися снаружи, не выходя из помещения. Но если это обстоятельство еще можно было отнести к разряду удобных, то комары, в изобилии проникавшие в дом сквозь щели, просто отравляли существование. Спасительное средство – тлеющий пиретрум. Наверное, в тихую погоду из-за пиретрумного дыма, выходящего из тех же щелей, лаборатория могла смахивать на действующую коптильню.
Приходилось приспосабливаться к полевым условиям, отсутствию водопровода и постоянного электричества. Самодельные деревянные холодильники, погреб со льдом помогали сохранять реактивы, растворы, собранные на нерестилищах образцы. Обычно привезенные образцы крови и мышц сразу начинали готовить к анализу и проводили электрофорез. Поскольку активность ферментов при хранении образца без замораживания быстро падает, именно анализ свежего материала обеспечивал качественный результат. Словом, хоть и не шикарно, но вполне можно было работать.
Во втором полевом сезоне появилась новая электростанция, проблем с которой почти не было. Силами самих сотрудников были построены дом для лаборатории генетики, большая лаборатория популяционной биологии и общежитие (с каминным залом!!!) для ее сотрудников. В лаборатории генетики теперь было все необходимое для дальнейшей работы, она стала не только удобной, но и уютной.
Генетический раздел полевых исследований в первые годы выполняли Ю. П. Алтухов – в качестве руководителя работ (после перехода в ИОГен он руководил работами нескольких аспирантов и соискателей, связанных с азабачинской неркой), Е. А. Салменкова, Л. Г. Волохонская, В. Т. Омельченко, А. И. Пудовкин, Н. А. Еранова, Н. И. Лаптинова. Очень большую роль в организации работы сыграли В. П. Бушуев, оказавшийся компетентным не только в научных вопросах, но и в строительстве, ремонте лодочных моторов и электростанции, а также Б. М. Рябов. В последующий период в работе участвовали Г. Д. Рябова, А. Ю. Новосельская, Л. И. Ильина, Л. А. Крайнюк и др.» (конец).
Свободное копирование
