В первую очередь надо было найти объект исследования, который можно изучать в двух физиологически различных состояниях с тем, чтобы сравнить наборы изоакцепторных тРНК в каждом из них. Затем можно было бы провести реакцию синтеза белков in vitro, совмещая в ней информационную РНК и ферментную систему из одного состояния с набором всех тРНК из другого состояния. Проанализировать весь спектр белков, синтезируемых в такой гетерогенной системе, и сравнить его с наборами белков, синтезируемых в гомогенных системах, когда информационные РНК, ферменты и тРНК были бы взяты из одного и того же состояния. Быть может, таким образом удалось бы показать, что набор синтезируемых белков действительно определяется набором дееспособных тРНК.
К счастью, такой во всех отношениях удобной объект уже существовал и физиологически был хорошо изучен. Его за несколько лет до того отыскал заведующий одной из лабораторий Института биологии развития, молодой, но очень талантливый исследователь Саша Нейфах. Я был с ним хорошо знаком.
Этим объектом служила маленькая рыбка вьюн, похожая на очень короткого (не более 30 см в длину) угря. Вьюны водятся в нашей средней полосе, особенно в старицах рек и в других неглубоких и стоячих водоемах. Их Саше пару раз в месяц привозил в двух больших бидонах (самцы и самки отдельно) очень колоритный, высокий и жилистый старик. Он знал. наверное, все места в центральной России, где водится вьюн. Держал их в секрете. Теперь и я стал его клиентом. В оплату за труды старика зачислили в Институт лаборантом. Вьюны предпочитают температуру не выше 20°С. Я их хранил в нескольких больших пластмассовых баках для белья, штук по 50 в каждом, в «холодной комнате» при +4°С. Там они благополучно дремали до очередного опыта. Кормить их не было нужды — только ежедневно менять воду. Отработанная Нейфахом процедура получения оплодотворенной икры была достаточно простой. Самкам вкалывали половой гормон хориогонин и через 39 часов пребывания при температуре +17°С легко выдавливали из них икру в плоскую и неглубокую стеклянную чашку с небольшим количеством воды. Заблаговременно, вспоров брюшко у самцов, извлекали семенники, нарезали их на мелкие кусочки, которые раздавливали в ступке с несколькими миллилитрами слабого солевого раствора. В чашку с икрой через смоченную водой марлю выдавливали экстракт из семенников. При осторожном перемешивании происходило оплодотворение — икра явно набухала... Далее Саша следил за ранним развитием зародышей в тех же чашках, помещая их в термостат при температуре 21,5°С. Время от времени чашки покачивали для улучшения аэрации. Уже через 2 часа в бинокулярную лупу можно было видеть, как на поверхности икринки появлялся первый «пузырек». Затем он делился надвое, потом еще деление и так далее. На икринке нарастает «шапочка» (бластодерма). Это уже зародыш. В течение первых 20 часов он проходит ранние стадии развития (морула — бластула — гаструла). На глаз это заметно как увеличение бластодермы и уменьшение размеров образующих ее клеток. Считается, что через 20 часов в зародыше начинаются процессы «органогенеза». Я не пытался вникнуть в тонкости физиологической эволюции зародыша. Мне было достаточно уверенности в том, что по мере его развития в клетках бластодермы начинают синтезироваться новые, характерные для каждой последующей стадии белки. Эту уверенность разделял и Нейфих. Открывалась возможность обнаруживать изменения белкового состава и наборов тРНК в зародышах с разных стадий развития.
Не устраивали меня только масштабы работы Нейфаха. Ему для наблюдений достаточно было располагать икрой из трех-четырех рыб. А мне для осуществления последующих операций фракционирования белков и тРНК надо было запускать в процесс одновременного развития икру из, по меньшей мере, полусотни рыб. Выращивание зародышей на чашках для этого не годилось. Из нижней половины разрезанной стеклодувом 20-литровой бутылки от реактивов, настольного малогабаритного вентилятора, жидкостного термостата и некоторых вспомогательных устройств мне удалось соорудить прибор, в котором благодаря непрерывной циркуляции 10 литров взвеси икринок в воде происходило нормальное развитие зародышей. (Как ни странно, повторить эту конструкцию не удалось никому, даже Нейфаху — у них икра не росла.)
Не буду описывать процедуры отделения и очистки бластодерм любой стадии развития от «желтка» — самой икринки с ее запасом питательных веществ. Все эти процедуры были отработаны Нейфахом. Важно то, что в результате удавалось получить (в зависимости от стадии развития) от 2 до 5 грамм зародышевого материала. Этого было достаточно для проведения всех многочисленных и тонких операций по вскрытию клеток зародыша, извлечению из них нужных фракций, постановке опытов in vitro и последующего анализа результатов этих опытов.
Ограничусь замечанием, что отработка всех методик и проведение самих экспериментов потребовали от меня и моих двух лаборанток напряженной работы в течение девяти лет. После чего постараюсь вкратце изложить полученные результаты, разбив всю работу на три этапа.
Свободное копирование
