В конце 70-го года я наконец перебрался в лабораторию Баева и принял на себя обязанности заместителя заведующего лабораторией.
Обязанности чисто административные. Сбор ежегодных заявок на стеклянную посуду и реактивы от руководителей групп. Их распределение после, как всегда, неполного удовлетворения этих заявок. То же в отношении лабораторного оборудования. Направление молодых сотрудников в подшефный колхоз на сельскохозяйственные работы. Или поочередно всех — на ближайшее овощехранилище для переборки гниющих овощей и фруктов. Присутствие на всевозможных административных совещаниях в дирекции. Разумеется, не научных. Научная тематика меня не касалась, если не считать того, что я был обязан в установленные сроки собирать ежегодные планы работ и отчеты руководителей групп. (Как будто можно заранее планировать результат исследовательской работы! В план записывали то, что фактически уже было сделано...) Все это дела скучные, но не обременительные. Зато Баев добился для меня звания старшего научного сотрудника. Я снова стал получать 300 рублей в месяц, которые 10 лет назад мне платили у Черниговского. Кроме того, я получил комнату для собственной научной работы и ставку лаборанта. На эту ставку я принял Полину С. Вскоре понял, что выбор мой не совсем удачен. Она очень тщательная и исполнительная лаборантка. Но, несмотря на высшее биологическое образование, человек, категорически не желающий читать научную литературу или брать на себя решение какой-либо мало-мальски самостоятельной задачи. Она не замужем, охотно остается в лаборатории вместе со мной до позднего вечера. Наверное, следовало бы заменить Полину на более творчески ориентированного, честолюбивого молодого человека. Но мне ее жаль — кто знает, как со своими странностями она себя будет чувствовать в другом месте. В течение первых нескольких лет упорно стараюсь вовлечь ее в научное сотрудничество. Я же вижу, что голова у нее хорошая. А когда прихожу к убеждению, что это безнадежно, мы уже настолько сработались, почти сроднились, что я не могу просить ее оставить лабораторию. Через пару лет у меня появится еще одна лаборантка, Валюша. Живая, проворная, тоже исполнительная, но без образования и каких-либо данных к научному мышлению.
Так до последнего дня работы в ИМБ я буду обречен не только вынашивать свои планы в одиночку, но и подробно расписывать все опыты. Но это еще впереди. Сначала свою тематику мне надо найти. Две вещи очевидны с самого начала. Моя исследовательская работа должна быть как-то связана с тРНК, поскольку под этим «флагом» существовала лаборатория. И она должна быть оригинальной. В 47 лет поздно тратить силы на эпигонские работы, идти в хвосте у американских ученых. С этого имеет смысл начинать лет в двадцать пять.
В течение первых нескольких месяцев штудирую научную литературу, главным образом журнальные статьи, относящиеся к тРНК. Мое внимание привлекают две старые публикации: Эймса и Хартмана в 63-м году и Стента — в 65-м. В первой из них предполагалось, что среди 61 кодирующей тройки нуклеотидов ДНК есть некоторое число «модулирующих кодонов», которым соответствуют особые «модуляторные тРНК». Их функциональное отличие состоит в том, что момент «узнавания» модулирующего кодона модуляторной тРНК является критическим. За ним может последовать отделение информационной РНК от рибосомы или ее существенная задержка на одном месте. В статье Стента было высказано предположение, что подавление биосинтеза определенных белков может зависеть от нарушения нормальной работы ферментов, модифицирующих эти самые модуляторные тРНК. Такими ферментами, в частности, могут оказаться метилазы и другие ферменты, трансформирующие нормальные нуклеиновые основания этих тРНК в миноры. Оба высказывания не подкреплены никакими экспериментальными данными. И, насколько я мог судить по отсутствию соответствующих публикаций, попытки получить такие данные не делались (или не удавались). Опираясь на цитированные предположения, я выработал свою, более полную гипотезу. О ней я расскажу позднее, когда представится возможность приступить к ее экспериментальной проверке.
А пока Александр Александрович предложил мне заняться тщательной характеристикой метилаз для тРНК. Ну что ж — метилазы так метилазы! Если я когда-нибудь подойду к заключительным этапам проверки своей гипотезы, мне эти характеристики пригодятся.
В качестве объекта метилирования использую тРНК бактерии E.coli K12W6 (CH3-). Указанное в скобках означает, что эта бактерия «дефицитна» по СН3, иными словами, не может расти на обычной питательной среде, так как не способна синтезировать СН3-группу. А следовательно, и метилировать все подлежащие метильной «миноризации» тРНК. Выращивание культуры этих бактерий ведется на питательной среде с добавкой вещества, способного поставлять метильную группу. Это вещество S-аденозил-[метил-14С] метионин. Сокращено 14С-SAM. Оно не только обеспечивает рост бактерий метилом, но вносит метил, радиоактивно меченный по углероду. Выделенная и очищенная из таких бактерий тРНК метилирована (радиоактивно) собственными метилазами. Для исследования активности посторонних метилаз мы выращивали, насколько это было возможно, наши неполноценные бактерии в питательной среде, обедненной по донорам нерадиоактивного метила. Выделяли заведомо не полностью метилированную суммарную тРНК. Затем в пробирке («in vitro») вели ее дометилирование — в пробирку вносили суммарную белковую фракцию из другого источника. В ней наряду с прочими ферментами были и метилазы. Разумеется, туда же добавляли с запасом и 14С-SAM. Инкубировали несколько часов при 37°С. Выделяли из смеси суммарную тРКН, уже меченную радиоактивным метилом (из 14С-SAM). Проводили полное расщепление всех тРНК до нуклеиновых оснований. (Обработка 65%-ной хлорной кислотой в запаянной ампуле 1,5 часа при 100°С). Разделение всех нуклеиновых оснований производили методом колоночной хроматографии. Положение «пиков» всех нормальных нуклеиновых оснований на хроматограмме[1] было заранее определено по ультрафиолетовому поглощению в тех же условиях разделения. Метилированные миноры выходили из колонки отделенными от четырех нормальных оснований. Положение «пиков» миноров, зафиксированное по радиоактивности, на всех хроматограммах было неизменным. Активность соответствующих метилаз оценивали по величине радиоактивности, измеренной в каждом из «пиков» соответствующих миноров.
В результате было обнаружено, что относительная активность различных метилаз (производящих разные миноры) зависит от выбора их источника: мы сравнивали нормальную бактерию E.coli, печень крысы, гепатому Новикова, молочную железу коровы. Еще зависит от степени кислотности инкубационной среды, от концентрации в ней ионов магния и от соотношения количеств тРНК и ферментной фракции. Вплоть до 6 часов инкубации включение радиоактивного метила увеличивалось пропорционально времени. Все опыты дублировались для проверки воспроизводимости результатов. Для каждого из источников метилаз на основании этих опытов определяли оптимальные условия инкубации in vitro. Описанные опыты заняли у нас с Полиной два года, 71-й и 72-й.
Свободное копирование
